Analisis DNA

Analisis RFLP

Metode pertama untuk mencari tahu genetika digunakan untuk profiling DNA terlibat analisis RFLP . DNA dikumpulkan dari sel-sel, seperti sampel darah, dan dipotong kecil-kecil dengan menggunakan enzim restriksi (pembatasan digest). Ini menghasilkan ribuan fragmen DNA yang berbeda ukuran sebagai konsekuensi dari variasi antara urutan DNA dari individu yang berbeda. Potongan tersebut kemudian dipisahkan berdasarkan ukuran menggunakan gel elektroforesis .

Fragmen dipisahkan kemudian ditransfer ke nitroselulosa atau nilon filter; prosedur ini disebut blot Southern . Fragmen DNA dalam blot secara permanen tetap ke filter, dan untai DNA didenaturasi. Molekul probe radiolabeled kemudian menambahkan bahwa melengkapi urutan dalam genom yang mengandung urutan ulangi. Urutan ulangi ini cenderung bervariasi panjang antara individu-individu yang berbeda dan disebut variabel jumlah tandem repeat urutan atau VNTRs. Molekul probe berhibridisasi dengan fragmen DNA yang mengandung urutan ulangi dan molekul probe kelebihan hanyut. Blot tersebut kemudian terkena film X-ray. Fragmen DNA yang telah terikat probe muncul band-band gelap pada film.

Namun, teknik Southern blot adalah sulit, dan membutuhkan sejumlah besar DNA sampel Undegraded. Juga, teknik asli Karl Brown melihat banyak minisatelit lokus pada saat yang sama, meningkatkan variabilitas yang diamati, tetapi membuat sulit untuk membedakan individu alel(dan dengan demikian menghalangi pengujian orangtua ). Teknik-teknik awal telah digantikan oleh PCR tes berbasis.

PCR analisis

Dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1983, sebuah proses yang dilaporkan oleh bagian tertentu dari sampel DNA dapat diperkuat hampir tanpa batas (Saiki et al. 1985, 1988). Hal ini telah merevolusi seluruh bidang studi DNA. Proses, reaksi berantai polimerase (PCR), meniru proses biologis replikasi DNA , tetapi batas-batas ke urutan DNA tertentu yang menarik. Dengan penemuan teknik PCR, DNA profiling mengambil langkah besar ke depan di kedua kekuatan diskriminatif dan kemampuan untuk memulihkan informasi dari sampel awal yang sangat kecil (atau rusak).

PCR sangat menguatkan jumlah wilayah tertentu dari DNA. Dalam proses PCR, sampel DNA didenaturasi menjadi individu yang terpisah polinukleotida untai melalui pemanasan.Dua oligonukleotida DNA primer yang digunakan untuk berhibridisasi ke dua situs yang sesuai terdekat untai DNA berlawanan sedemikian rupa bahwa perpanjangan enzimatik normal dari terminal aktif masing-masing primer (yaitu, ujung 3 ') mengarah ke arah primer lainnya. PCR menggunakan enzim replikasi yang toleran terhadap suhu tinggi, seperti termostabil Taq polimerase . Dengan cara ini, dua salinan baru dari urutan bunga yang dihasilkan. Denaturasi berulang, hibridisasi, dan penyuluhan dengan cara ini menghasilkan jumlah tumbuh secara eksponensial salinan DNA yang menarik. Instrumen yang melakukan siklus termal sekarang tersedia dari sumber-sumber komersial.Proses ini dapat menghasilkan amplifikasi juta kali lipat atau lebih besar dari wilayah yang diinginkan dalam 2 jam atau kurang.

Tes awal seperti HLA - DQ alpha membalikkan dot blot strip tumbuh menjadi sangat populer karena kemudahan penggunaan, dan kecepatan yang hasilnya dapat diperoleh.Namun, mereka tidak membedakan analisis RFLP. Itu juga sulit untuk menentukan profil DNA untuk sampel campuran, seperti swab vagina dari kekerasan seksual korban.

Namun, metode PCR adalah mudah beradaptasi untuk menganalisis VNTR , khususnya STR lokus. Dalam beberapa tahun terakhir, penelitian kuantisasi DNA manusia telah difokuskan pada baru "real-time" PCR kuantitatif (qPCR) teknik. Metode PCR kuantitatif mengaktifkan otomatis, tepat, dan tinggi-throughput pengukuran. Studi antar laboratorium telah menunjukkan pentingnya kuantitasi DNA manusia untuk mencapai interpretasi yang dapat diandalkan dari STR mengetik dan mendapatkan hasil yang konsisten di laboratorium.

Analisis STR

Metode profiling DNA digunakan saat ini didasarkan pada PCR dan menggunakan mengulangi tandem pendek (STR). Metode ini menggunakan daerah-daerah yang sangat polimorfik yang pendek diulang urutan DNA (yang paling umum adalah 4 basa berulang, tetapi ada panjang lain digunakan, termasuk 3 dan 5 basis). Karena orang-orang yang tidak terkait hampir pasti memiliki perbedaan jumlah unit berulang, STR dapat digunakan untuk membedakan antara individu yang tidak berhubungan. Ini STR lokus (lokasi pada kromosom) ditargetkan dengan primer-urutan tertentu dan diperkuat dengan menggunakan PCR . Fragmen DNA yang dihasilkan kemudian dipisahkan dan dideteksi dengan menggunakan elektroforesis . Ada dua metode umum pemisahan dan deteksi, elektroforesis kapiler (CE) dan gel elektroforesis .

Setiap STR adalah polimorfik, tetapi jumlah alel sangat kecil. Biasanya masing-masing alel STR akan dibagi oleh sekitar 5 - 20% dari individu. Kekuatan analisis STR berasal dari melihat beberapa lokus STR secara bersamaan. Pola alel dapat mengidentifikasi individu cukup akurat. Analisis sehingga STR menyediakan alat identifikasi yang sangat baik. Semakin banyak daerah STR yang diuji dalam individu yang lebih membedakan tes menjadi.

Dari satu negara ke negara, sistem DNA-profil STR berbasis berbeda sedang digunakan. Di Amerika Utara, sistem yang memperkuat CODIS 13 lokus inti hampir universal, sedangkan di Inggris yang SGM + sistem lokus 11 (yang kompatibel dengan The National DNA database ), sedang digunakan. Apapun sistem yang digunakan, banyak daerah STR yang digunakan adalah sama. Sistem DNA-profil ini didasarkan pada reaksi multiplex, dimana banyak daerah STR akan diuji pada waktu yang sama.

Kekuatan sebenarnya dari analisis STR adalah kekuatan statistik yang diskriminasi. Karena 13 lokus yang saat ini digunakan untuk diskriminasi dalam CODIS yang independen berbagai macam (memiliki sejumlah mengulangi pada satu lokus tidak mengubah kemungkinan memiliki sejumlah mengulangi pada setiap lokus lainnya), aturan produk untuk probabilitas dapat diterapkan . Ini berarti bahwa, jika seseorang memiliki jenis DNA dari ABC, di mana tiga lokus yang independen, kita dapat mengatakan bahwa kemungkinan memiliki jenis DNA adalah kemungkinan memiliki tipe A kali kemungkinan memiliki kali tipe B kemungkinan memiliki ketik C. Hal ini menyebabkan kemampuan untuk menghasilkan probabilitas pertandingan dalam 1 triliun (1x10 ¹⁸ ) atau lebih. Namun, pencarian basis data DNA menunjukkan jauh lebih sering dari yang diharapkan palsu pertandingan profil DNA. Selain itu, karena ada sekitar 12 juta kembar monozigot di Bumi, kemungkinan teoritis tidak akurat.

Dalam prakteknya, risiko terkontaminasi-matching jauh lebih besar daripada pencocokan relatif jauh, seperti kontaminasi sampel dari benda-benda di dekatnya, atau dari kiri-atas sel ditransfer dari tes sebelumnya. Risikonya lebih besar untuk pencocokan orang yang paling umum dalam sampel: Semuanya dikumpulkan dari, atau kontak dengan, korban merupakan sumber utama kontaminasi untuk setiap sampel lainnya dibawa ke laboratorium. Untuk itu, beberapa kontrol sampel biasanya diuji untuk memastikan bahwa mereka tetap bersih, ketika disiapkan selama periode yang sama sebagai sampel tes yang sebenarnya. Pertandingan yang tak terduga (atau variasi) di beberapa kontrol sampel menunjukkan probabilitas tinggi kontaminasi untuk sampel tes yang sebenarnya. Dalam tes hubungan, profil DNA penuh harus berbeda (kecuali untuk kembar), untuk membuktikan bahwa seseorang tidak benar-benar cocok sebagai terkait dengan DNA mereka sendiri dalam sampel lain.

AmpFLP

Teknik lain, AmpFLP, atau diperkuat polimorfisme panjang fragmen juga dipraktekkan selama awal 1990-an. Teknik ini juga lebih cepat dari analisis RFLP dan digunakan PCRuntuk memperkuat sampel DNA. Ini bergantung pada variabel jumlah tandem repeat (VNTR) polimorfisme untuk membedakan berbagai alel, yang dipisahkan pada gel poliakrilamid menggunakan tangga alel (sebagai lawan tangga berat molekul). Band dapat divisualisasikan dengan pewarnaan perak gel. Satu lokus populer untuk sidik jari adalah lokus D1S80. Seperti semua metode berbasis PCR, DNA yang sangat terdegradasi atau jumlah yang sangat kecil dari DNA dapat menyebabkan putus sekolah alel (menyebabkan kesalahan dalam berpikir heterozigot adalah homozigot a) atau efek stokastik lainnya. Selain itu, karena analisis dilakukan pada gel, angka yang sangat tinggi mengulangi Mei sekelompok bersama-sama di bagian atas gel, sehingga sulit untuk menyelesaikan. Analisis AmpFLP dapat sangat otomatis, dan memungkinkan untuk penciptaan mudah filogenetik pohon berdasarkan membandingkan sampel individu dari DNA. Karena biaya dan kemudahan set-up dan operasi yang relatif rendah, AmpFLP tetap populer di negara-negara berpenghasilan rendah.

Analisis hubungan keluarga DNA

Menggunakan PCR teknologi, analisis DNA secara luas diterapkan untuk menentukan hubungan keluarga genetik seperti ayah, bersalin, siblingship dan kinships lainnya.

Selama pembuahan, sel sperma ayah dan sel telur ibu, masing-masing berisi setengah jumlah DNA yang ditemukan dalam sel-sel tubuh lainnya, bertemu dan sekering untuk membentuk telur dibuahi, disebut zigot. Zigot berisi satu set lengkap molekul DNA, kombinasi yang unik dari DNA dari kedua orang tuanya. Zigot ini membagi dan mengalikan menjadi embrio dan kemudian, manusia penuh.

Pada setiap tahap perkembangan, semua sel yang membentuk tubuh mengandung DNA yang sama-setengah dari ayah dan setengah dari ibu. Hal ini memungkinkan pengujian hubungan menggunakan semua jenis dari seluruh sampel termasuk sel lepas dari pipi dikumpulkan menggunakan penyeka bukal, darah atau jenis sampel.

Sementara banyak DNA berisi informasi untuk fungsi tertentu, ada beberapa yang disebut junk DNA, yang saat ini digunakan untuk identifikasi manusia. Pada beberapa lokasi khusus (disebut lokus) dalam DNA sampah, pola warisan diprediksi telah ditemukan untuk menjadi berguna dalam menentukan hubungan biologis. Lokasi ini berisi penanda DNA spesifik bahwa para ilmuwan DNA digunakan untuk mengidentifikasi individu. Dalam tes DNA DNA rutin, tanda-tanda yang digunakan adalah pendek Tandem Repeats(STR), potongan pendek DNA yang terjadi dalam pola berulang yang sangat berbeda di antara individu.

DNA setiap orang mengandung dua salinan dari tanda tersebut-satu salinan diwarisi dari ayah dan satu dari ibu. Dalam populasi, penanda di lokasi DNA setiap orang bisa berbeda dalam panjang dan kadang-kadang urutan, tergantung pada penanda yang diwarisi dari orang tua.

Kombinasi ukuran penanda yang ditemukan di setiap orang membuat / profil genetik unik nya. Ketika menentukan hubungan antara dua individu, profil genetik mereka dibandingkan untuk melihat apakah mereka berbagi pola warisan yang sama pada tingkat statistik konklusif.

Sebagai contoh, laporan contoh berikut ini dari DNA pengujian paternitas laboratorium komersial Universal Genetika menandakan bagaimana keterkaitan antara orang tua dan anak-anak teridentifikasi pada orang-orang penanda khusus:

Hasil parsial menunjukkan bahwa anak dan pertandingan DNA dugaan ayah di antara lima spidol. Hasil tes menunjukkan korelasi yang lengkap ini pada 16 penanda antara anak dan orang diuji untuk menarik kesimpulan apakah atau tidak orang itu adalah ayah biologis.

Setiap marker diberikan dengan Indeks Tua (PI), yang merupakan ukuran statistik seberapa kuat pertandingan di penanda tertentu menunjukkan ayah. PI masing-masing marker dikalikan dengan satu sama lain untuk menghasilkan Paternity Indeks Gabungan (CPI), yang menunjukkan probabilitas keseluruhan seorang individu menjadi ayah biologis dari anak relatif diuji untuk setiap orang secara acak dari seluruh penduduk dari ras yang sama. CPI tersebut kemudian diubah menjadi Probabilitas Ayah menunjukkan tingkat keterkaitan antara dugaan ayah dan anak.

Laporan tes DNA dalam tes hubungan keluarga lainnya, seperti grandparentage dan siblingship tes, mirip dengan laporan tes DNA. Alih-alih Paternity Indeks Gabungan, nilai yang berbeda, seperti Indeks Siblingship, dilaporkan.

Laporan ini menunjukkan profil genetik dari setiap orang diuji. Jika ada penanda dibagi di antara individu-individu yang diuji, kemungkinan hubungan biologis dihitung untuk menentukan seberapa besar kemungkinan individu diuji berbagi penanda yang sama karena hubungan darah.

Analisa kromosom Y 

ovasi terbaru termasuk penciptaan primer menargetkan daerah polimorfik pada kromosom Y ( Y-STR ), yang memungkinkan resolusi sampel DNA campuran dari kasus pria dan wanita atau di mana ekstraksi diferensial tidak mungkin. Y-kromosom dari ayah diwariskan, sehingga analisis Y-STR dapat membantu dalam identifikasi laki-laki dari ayah terkait. Analisis Y-STR dilakukan di Sally Hemings kontroversi untuk menentukan apakah Thomas Jefferson telah menjadi bapak anak dengan salah satu budaknya. Analisis kromosom Y memberikan hasil yang lebih lemah dari analisis kromosom autosomal. Kromosom Y seks menentukan laki-laki, seperti yang diwariskan hanya oleh laki-laki dari ayah mereka, hampir identik sepanjang garis patrilineal. Hal ini menyebabkan analisis kurang tepat daripada jika kromosom autosomal yang menguji, karena pencocokan acak yang terjadi antara pasang kromosom sebagai zigot yang sedang dibuat.

Analisis mitokondria 

Untuk sampel yang rusak, kadang-kadang tidak mungkin untuk mendapatkan profil lengkap dari 13 CODIS STR. Dalam situasi ini, DNA mitokondria (mtDNA) kadang-kadang diketik karena ke sana menjadi banyak salinan mtDNA dalam sel, sementara ada mungkin hanya 1-2 salinan DNA nuklir. Ilmuwan forensik memperkuat HV1 dan wilayah HV2 dari mtDNA, dan kemudian urutan masing-masing daerah dan membandingkan perbedaan nukleotida tunggal untuk referensi. Karena mtDNA maternal diwariskan, kerabat ibu langsung terkait dapat digunakan sebagai referensi pertandingan, seperti putra putri satu nenek dari pihak ibu yang itu. Secara umum, perbedaan dari dua atau lebih nukleotida dianggap pengecualian. heteroplasmi dan perbedaan poli-C dapat membuang perbandingan urutan lurus, sehingga beberapa keahlian pada bagian analis diperlukan. mtDNA berguna dalam menentukan identitas yang jelas, seperti orang hilang ketika seorang kerabat maternal terkait dapat ditemukan. pengujian mtDNA digunakan dalam menentukan bahwa Anna Anderson bukanlah putri Rusia ia mengaku, Anastasia Romanov .

mtDNA dapat diperoleh dari bahan seperti poros rambut dan tulang tua / gigi. Mekanisme kontrol berdasarkan titik interaksi dengan data. Hal ini ditentukan oleh penempatan tooled dalam sampel.